BIOCHECK Inc.是新抗體發(fā)現(xiàn)和免疫測定開發(fā)服務(wù)的綜合提供商。利用我們專有的B細(xì)胞克隆技術(shù)，我們可以直接富集陽性B細(xì)胞，分離IgG基因并表達用于各種應(yīng)用的重組抗體。我們還是免疫診斷領(lǐng)域的開發(fā)商和制造商，在將新的IVD產(chǎn)品推向市場方面擁有豐富的經(jīng)驗。除了ELISA之外，我們現(xiàn)在還包括使用Simoa™技術(shù)（單分子陣列）進行超靈敏檢測的分析開發(fā)，這是一種檢測低豐度生物標(biāo)記物的強大工具。

PD-L1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT Catalog Number: BC-1303

pd-l1酶免疫測定試劑盒目錄編號：bc-1303

酶免疫法定量測定人血清和血漿中Pd-L1的濃度

只作研究用途

不適用于診斷程序

介紹

程序性死亡受體-配體1(pd-l1，b7-h1，cd 274)是b7家族的一種生物標(biāo)志物，在多種細(xì)胞上表達，并在多種促炎細(xì)胞因子(如int)作用下被上調(diào)。 ERFERFON GAMMA 1，2，3。pd-L1與耗盡的T細(xì)胞表達的輔助受體pd-1相互作用，通過減少T細(xì)胞受體介導(dǎo)的增殖，促進免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成。 N和細(xì)胞因子產(chǎn)生4，5。pd-1/pd-l1相互作用在免疫編輯過程中起著免疫檢查點的作用，宿主免疫系統(tǒng)在此過程中消除了高免疫原性腫瘤。 使較少的免疫原性腫瘤逃避2，6。包括黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種實體腫瘤類型利用pd-1/pd-L。 1免疫編輯機制。目前的治療主要集中在阻斷PD-1/Pd-L1相互作用，通過抑制Pd-1來減少腫瘤的逃逸，而Pd-L1和1，2則是新的研究重點。

測定原理

pd-L1酶聯(lián)免疫吸附試驗基于固相酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理.該檢測系統(tǒng)利用一種*的單克隆抗體對，針對一種*的抗原性測定方法。 Pd-L1分子上的螞蟻。用一種小鼠抗Pd-L1單克隆抗體進行固相固定化(在微滴度井上)。另一種與馬血清結(jié)合的單克隆抗pd-l1抗體 盤過氧化物酶(HRP)存在于酶的共軛溶液中。測試樣本被允許與這兩種抗體順序反應(yīng)，導(dǎo)致pd-l1分子被夾在溶膠之間。 ID期和酶解抗體。在室溫下進行兩次單獨的60分鐘孵育后，用洗滌緩沖液沖洗水井，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體。添加TMB試劑 ED在黑暗條件下孵育20分鐘，形成藍色。隨著停止解決方案的添加，顏色開發(fā)停止，將顏色更改為黃色。 Pd-L1的濃度與樣品的顏色強度成正比。在450 nm處分光度法測定吸光度。

提供的試劑和材料

1.抗體包被井(1板，96井)微滴度井，用小鼠單克隆抗pd-l1包被。

2.20 ng/ml Pd-L1標(biāo)準(zhǔn)品(0.5 mL/小瓶)20 ng/mL Pd-L1在含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-BSA溶液中

3.標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑和樣品稀釋劑(30 mL/瓶，1瓶)含有含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-bsa溶液。

4.酶結(jié)合試劑(12 mL/小瓶，1小瓶)含有與辣根過氧化物酶結(jié)合的小鼠單克隆抗pd-l1。

20倍洗滌劑磷酸鹽緩沖液(50 mL/瓶，1瓶)

TMB試劑(11 mL/瓶，1瓶)含有一步TMB溶液。

7. 停液(11 mL/瓶，1瓶)含有稀釋鹽酸(1NHCl)

貯藏條件

1.將未打開的工具包保存在2-8°C，收到后，當(dāng)它沒有使用，直到到期顯示在工具包標(biāo)簽上。有關(guān)過期日期，請參閱包標(biāo)簽。

2.將微滴度板放在一個裝有干燥劑的密封袋中，以盡量減少對潮濕空氣的暴露。

試劑準(zhǔn)備

1.所有試劑在使用前應(yīng)允許達到室溫(18-25°C)。

2.對于每次測試運行，準(zhǔn)備一個新的標(biāo)準(zhǔn)集。

3.稀釋20 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品至5ng/mL。用標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑制備5納克/mL標(biāo)準(zhǔn)的兩倍系列稀釋劑：

a.5 ng/mL：0.15mL 20 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑0.45mL

b.2.5納克/毫升：0.25毫升5納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑

c.1.25納克/毫升：0.25毫升2.5納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑

d.0.625 ng/mL：1.25ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑0.25mL

e.0.313 ng/mL：0.25mL 0.625 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑

f.0.156 ng/mL：0.25mL 0.313 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑

g.0.078 ng/mL：0.25mL 0.156 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑

H.0 ng/mL：0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑

5.病人樣本在使用前需要稀釋4倍。制備一系列小管(即1.5 mL微離心管)，將60L血清與180 L標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑混合。

6. 工作洗滌緩沖器：從20倍庫存中制備1倍洗滌緩沖液。加入50毫升的20倍洗滌緩沖液庫存到950毫升的直接水。工作洗滌緩沖液在2~8°C溫度下穩(wěn)定運行30天.注：任何晶體 這可能是由于高鹽濃度的存在，必須在室溫下再溶解，然后再進行稀釋。

檢測程序

1.準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)。見試劑準(zhǔn)備。

2.稀釋樣品1：4稀釋。見試劑準(zhǔn)備。

3.確保所需數(shù)量的涂層井在保持架。

4.配發(fā)Pd-L1標(biāo)準(zhǔn)的100mL，并將樣品稀釋到適當(dāng)?shù)木?

5.室溫(18-25°C)孵育60 min.

6.將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把井打在吸水性紙或p上 錐度毛巾，以消除所有殘余水滴。

7.將pd-L1工作酶結(jié)合劑的100mL分配到每口井中.

8.室溫(18-25°C)孵育60 min.

9.將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把井打在吸水性紙或p上 錐度毛巾，以消除所有殘余水滴。

10.在每口井中分配100mL TMB溶液。

11.室溫(18-25°C)孵育20分鐘.

12.通過在每口井中加入100mL的停止溶液來停止反應(yīng)。

13.輕輕攪拌30秒。重要的是要確保所有的藍色*變成黃色。

14. 在450 nm處讀取吸光度，15分鐘內(nèi)使用微滴度良好的閱讀器。

統(tǒng)計

1.計算每組參考標(biāo)準(zhǔn)、對照和樣品的平均吸光度值(OD 450)。

2.通過繪制每個參考標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度(以納克/毫升為單位)繪制在圖表紙上，在垂直(Y)軸上繪制吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 水平(X)軸的接觸。

3.用每個樣品的平均吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定相應(yīng)的Pd-L1濃度(ng/mL)。取決于經(jīng)驗和/或Comput的可用性 可以采用其他的數(shù)據(jù)縮減方法。

4.得到的樣品值應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)為4，才能得到Pd-L1的結(jié)果納克/毫升。

標(biāo)準(zhǔn)曲線實例

一個典型的標(biāo)準(zhǔn)運行結(jié)果，吸光度讀數(shù)在450 nm處顯示在Y軸上，而pd-L1濃度顯示在X軸上。注：本標(biāo)準(zhǔn)曲線為圖示目的。 僅用于計算未知數(shù)，不應(yīng)用于計算未知數(shù)。每個實驗室必須在每個實驗中生成自己的數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

工作特性

用2SD法測定的Pd-L1酶聯(lián)免疫吸附試驗的低檢出濃度為0.02ng/ml，低檢出濃度為0.02ng/ml。

精度a.在一次測定中，通過對三種不同樣品的重復(fù)測定，確定了內(nèi)測精密度.批內(nèi)可變性如下所示：

b.在一系列單獨校準(zhǔn)的測試中，通過對三個不同樣本的重復(fù)測量，確定了運行間精密度。批間變異顯示b。 below在下面，到下面

• 回收率和線性研究。回收樣品加入已知的Pd-L1水平，并一式兩份進行測定。平均回收率為90%。

b. 對三個樣品進行連續(xù)稀釋，以確定線性度。平均回收率為110.3%。

參考

1.赫布斯特，羅伊S.，等人。腫瘤患者對抗PD-L1抗體MPDL3280A的反應(yīng)預(yù)測相關(guān)。“自然”515.7528(2014年)：563。

2.帕特爾，桑迪普·普拉文和拉澤爾·庫茲洛克。pd-L1的表達是腫瘤免疫治療中的一個預(yù)測生物標(biāo)志物。分子癌癥治療學(xué)14.4(2015)：847-856。

3.書名/作者責(zé)任者：by L.靶向PD-1/B7-H1(PD-L1)通路，激活抗腫瘤免疫。免疫學(xué)新意見24.2(2012年)：207-212。

4.布蘭克克里斯汀和安德烈亞斯·馬肯森。PD-L1/PD-1通路對T細(xì)胞衰竭的貢獻：慢性感染和腫瘤逃避的新研究進展。癌癥免疫學(xué) 治療，療法，療效 56.

5(2007)：739-745。5.Barber，Daniel L.，等。慢性病毒感染時衰竭CD8 T細(xì)胞的功能恢復(fù)“自然”439.7077(2006年)：682。

6.Teng，Michele WL，等。根據(jù)T細(xì)胞浸潤和pd-L1分類癌癥。癌癥研究75.11(2015)：2139-2145。

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