用于樹突和樹突棘浸染的GOLGT-COX染色系統(tǒng)-上海起發(fā)

                            于體外研究

    Bioenno Golgi Kit是一種基于高爾基染色法設(shè)計出來的試劑盒，用于浸染神經(jīng)元樹突和樹突棘（參見下面的參考文獻）。該試劑盒在大鼠、小鼠、貓、兔和猴子以及人類死亡后所獲得的新鮮腦組織上進行了廣泛多次的測試，確定了該試劑盒能將樹突和樹突棘穩(wěn)定和高質(zhì)量的染色（見圖A-C）。大多數(shù)神經(jīng)元根據(jù)其組織年齡大小，用該試劑盒浸漬需要7-14天（見表2）。試劑盒儲存在室溫（4-25ºC）下的黑暗區(qū)域。

圖中為用Bioenno Golgi Kit侵染的樹突分支和樹突棘

（A）：低倍率（4×物鏡）顯微鏡照，顯示海馬體中高爾基體浸漬的神經(jīng)元。

（B）：從尾狀后肌取出的紋狀體神經(jīng)元。左側(cè)面板框架區(qū)域中的樹突棘（20×），在右側(cè)圖片中放大顯示（箭頭，63×）。

（C）：從皮質(zhì)采取的錐體神經(jīng)元。 中間面板框架區(qū)中樹突分支上的樹突棘（20×）被放大顯示在 斜（左，100×）和 主（右，100×）中。 這個階段常觀察到類似絲狀偽足的突起（左側(cè)圖片的箭頭）。

參考文獻：

• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.

• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.

• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.

• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.

保質(zhì)期：套件中的物品保質(zhì)期為自購買之日起的12個月之內(nèi)。

退貨政策：Bioenno Tech對此產(chǎn)品的退貨政策是自購買之日起90天之內(nèi)。

隨套件提供的材料：

•溶液A：浸漬溶液（240 ml×2瓶）。溶液A是工作液，在底部看到沉淀物是正常現(xiàn)象，實驗只需使用其上清液。

•試劑B：用于制備兩種工作緩沖液。

緩沖液1：浸漬后緩沖液（30 g×5 瓶）制備方法：在90 ml dH₂O中稀釋 30g 試劑B

緩沖液2：收集和安裝緩沖液（30 g×5 瓶）制備方法：在500 ml dH₂O中稀釋30 g試劑B

工作緩沖液可在4ºC下儲存長達4周。

•溶液C：染色溶液（220 ml×2 瓶）。所提供的溶液C需在使用前用dH₂O（體積比為3：5）稀釋。

例如，18ml溶液C + 30ml dH₂O→48ml工作液，試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。 48ml工作液可用于多達120個切片（例如，在所提供的染色罐中總共有10個載玻片，每個載玻片黏附有12個鼠腦切片）。

•試劑D：復(fù)染緩沖液（90 g×2 瓶）。使用前需用dH₂O稀釋試劑。

在500 ml dH₂O中稀釋90 g試劑D形成工作液。工作液可在室溫下儲存長達3個月。

48ml工作液可用于多達120個切片（例如，如上所述在染色罐中的12個切片×10個載玻片）。

•還包含：

著色筆（大，扁平，1 只），用于切片轉(zhuǎn)移;

圓頭筆（小，1 個），用于切片安裝;

帶蓋的染色罐（2個），用于存儲，染色和清洗粘連在粘性顯微鏡載玻片上的切片。

套件不提供的必要材料：

蒸餾水或去離子水（dH₂O）;

0.01M PBS-T（見表1）;

塑料或玻璃管和瓶子;

塑料鉗;

組織學(xué)用品和設(shè)備：粘合劑，顯微鏡載玻片，蓋玻片，光學(xué)顯微鏡，震動切片機或微切片機，乙醇，二甲苯或二甲苯替代品，Permount®封片劑。

表1：制備0.01M PBS-T，需先配制0.1M PB（左），然后配制含有0.3％Triton X-100的PBS（右）。

存儲、安全和處理注意事項：

·•將試劑盒存放在室溫下。

·•試劑盒中的溶液A和C為含劇毒試劑。 需在通風(fēng)櫥中準備并使用，使用完后收集所有廢物。

•  套件A中含有用于危險廢物處理的瓶子。

·•在處理試劑盒試劑時，需戴上手套，眼睛和面部有適當(dāng)?shù)姆雷o以及穿戴合適的防護服，處理后需*清洗雙手。

·•處理時避免試劑的吸入和接觸皮膚，眼睛。 如接觸，立即用水*清洗，必要時尋求醫(yī)療援助。

建議：

·•在處理溶液A和C時使用帶蓋的玻璃或塑料容器。

·•始終保持容器密閉。不要使用金屬工具來承裝溶液A。

·•使用溶液A，C或D處理大腦或切片時，避免大腦或切片受光照影響。

·•不要重復(fù)使用或稀釋工作液，在室溫下進行實驗以獲得宜效果。

1.浸漬：將剛收獲的腦組織浸入溶液A中。溶液A的體積大約是組織塊體積的10倍。 例如， 20ml溶液A對應(yīng)成年大鼠腦（1cm×1cm×2cm）體積。

浸泡1~2天后更換溶液，并在室溫下繼續(xù)避光浸漬（建議浸漬天數(shù)見表2）。

意見建議：為了獲得宜侵染，建議用生理鹽水灌注動物，清除組織中的血液。 麻醉動物（例如用戊巴匕匕妥鈉，腹膜內(nèi)注射100mg / kg）。心臟內(nèi)或升主動脈用0.9％生理鹽水（例如 1000ml dH₂O中含有9g NaCl）灌注至內(nèi)臟血液量被沖洗掉。灌注通常需要3~5分鐘。 解剖大腦并將其謹慎地從頭骨上移除。用鋒利的刀片切割大腦至1厘米左右的厚度，在0.9％鹽水中短暫沖洗，然后浸入溶液A.

表2：20-22℃下建議的浸漬總天數(shù)（P：出生后一天; 如：P2表示“2天齡”）

組織塊的類型和大小的不同可能影響浸漬時間，理想的時間應(yīng)該通過實驗研究獲得。在大多數(shù)情況下較好的浸漬效果是在2周。如果浸漬超過2周，則可能出現(xiàn)非特異性染色體。

2.浸漬后：浸漬準備好后，用蒸餾水或去離子水（dH₂O）沖洗組織塊，然后將其轉(zhuǎn)移到套件B所制備的浸漬后緩沖液（30 g稀釋在90 ml dH₂O）中，并在室溫下避光儲存。 在浸泡一天后更新溶液，繼續(xù)浸泡一天。 在浸漬后2天后，將組織塊準備好切片。

組織塊可以在4°C的緩沖液中儲存長達1個月

3.切片：可以使用振動切片機或類似類型的切片機將大腦切割成厚度為100-200μm的切片。

切片應(yīng)收集在套件B所制備的收集和安裝緩沖液（30g試劑B，在500ml dH₂O中稀釋）中。

建議使用振動切片機或微切片機進行切片。如果切片機刻度范圍為1-10，則將速度和振幅設(shè)置為4級。 建議在分析樹枝狀分枝和樹突棘時使用100-200μm的厚度。 對于薄切片的切割（例如50μm），需將剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分鐘來去除刀片上的油漬。

切片過程可在溫度設(shè)定在-16°C ~ -20°C的低溫恒溫器中進行。

4.安裝：借助所提供的著色筆（大），將切片轉(zhuǎn)移到裝有收集和安裝緩沖液的填充盤（例如95×15mm培養(yǎng)皿）中。 使用圓頭筆（小），將切片安裝在粘性顯微鏡載玻片上。 1個載玻片上可安裝6~12個切片。

覆蓋切片：用吸水紙（例如濾紙）覆蓋濕的切片，然后通過輕壓載玻片來給吸水紙壓力，以增強切片與載玻片的粘附。

在室溫下風(fēng)干燥切片約1分鐘。 長時間暴露在干燥空氣中會導(dǎo)致切片破碎。

將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中（已提供）。 放置在封閉的染色罐中的載玻片可以在室溫下儲存一天。一個染色罐可以存儲多達10個載玻片。

5.染色：用0.01M PBS-T洗滌載玻片20~30分鐘，然后用dH₂O洗滌約1分鐘。 將載玻片置于用dH₂O稀釋后的溶液C（體積比 3：5）中，在封閉的染色罐中保持20±2分鐘（將罐子儲存在黑暗區(qū)域中），然后將載玻片在dH₂O中漂洗約1分鐘。

如“試劑盒提供的材料”中所述：溶液C必須在使用前用dH₂O（體積比為3：5）稀釋。例如，將18ml溶液C與30ml dH₂O混合，形成48ml工作溶液。試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。48ml工作液可用于多達120個切片（例如，在所提供的染色罐中總共10個載玻片，每個載玻片黏附有12個鼠腦切片）。

為獲得宜效果，請勿重復(fù)使用稀釋的工作溶液。

為了防止切片滑落，切勿在dH₂O中長時間洗滌。理想的染色時間應(yīng)由實驗研究獲得。通常較好的染色效果是在20分鐘左右。

6.復(fù)染色：將載玻片置于試劑D所制備的復(fù)染緩沖液中，在暗處中放置20分鐘后在0.01M PBS-T中洗滌10分鐘×3次。

（可選染劑：在PBS-T洗滌后，切片可用甲酚紫、甲基綠或其他合適的染色試劑復(fù)染。）

用dH₂O沖洗載玻片約1分鐘，然后風(fēng)干。當(dāng)切片不*干燥（通常需要5~10分鐘）時，將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中，或繼續(xù)下一步操作“清潔和覆蓋”。

載玻片可以在室溫條件下儲存在罐中一天。

為了防止長時間暴露在干燥空氣導(dǎo)致切片的碎片化，需將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中。

48ml復(fù)染緩沖液可用于多達120個切片（例如，如“5.染色”中所述，在染色罐中的12個切片×10個切片）。 為獲得宜效果，請勿重復(fù)使用工作溶液。

7.清潔和覆蓋：將載玻片在100％乙醇中脫水約10分鐘 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗約10分鐘 ×3次。 蓋玻片采用的是Permount®封片劑。

將superGolgi-染色用的切片儲存在室溫和黑暗區(qū)域。