TECOmedical 總?cè)酥?lián)素 ELISA說明書

TECOmedica TE1013使用說明書英文

TECO® 腎上腺髓質(zhì)素 ELISA 試劑盒

TECO® 總?cè)酥?lián)素 ELISA 試劑盒

提供的試劑和材料：

符號 描述 格式

1 抗體包被微孔 1 板

一幀中 8 個孔的 12 個分離條（總計 12 x 8），即用型

A 標(biāo)準(zhǔn)品 A 1 x 0.75 mL

2 ng/mL-凍干

B 標(biāo)準(zhǔn)品 B 1 x 0.75 mL

10 ng/mL-凍干

C 標(biāo)準(zhǔn)品 C 1 x 0.75 mL

30 ng/mL-凍干

D 標(biāo)準(zhǔn)品 D 1 x 0.75 mL

70 ng/mL-凍干品

E 標(biāo)準(zhǔn)品 E 1 x 0.75 mL

100 ng/mL-凍干

L 對照 1 1 x 0.5 mL

ng/ml– 凍干品，范圍如數(shù)據(jù)表所示

H 對照 2 1 x 0.5 mL

ng/ml– 凍干品，范圍如數(shù)據(jù)表所示

2 稀釋緩沖液 1 x 25 mL

即用型

3 抗體 HRP 結(jié)合物 1 x 12 mL

即用型

4 TMB 底物 1 x 12 mL

即用型

5 清洗緩沖液 1 x 50 mL

20 倍濃縮

7 微量滴定板粘合劑蓋 貳件

套件說明 1 x3 TECOmedical

儲存

將試劑盒儲存在 2-8 ℃ 下。請勿冷凍。將未使用的試劑儲存在 2-8 ℃ 下。

使用說明書

TECO® 總?cè)酥?lián)素試劑盒是一種靈敏的“雙位點”夾心酶聯(lián)免疫吸附體外試驗，用于定量測定人血漿和血清中的脂聯(lián)素。

臨床應(yīng)用

• 肥胖
• 動脈硬化
• 能量代謝
• 冠心病
• 多囊卵巢綜合征

脂聯(lián)素是一種分子量為 30 kDa 的蛋白質(zhì)，占血清蛋白的 0.01%。主要由脂肪細(xì)胞合成，但肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞也具有合成脂聯(lián)素的能力。直到現(xiàn)在，IGF-I 是已知的合成天然誘導(dǎo)劑。它由膠原蛋白樣 N 末端和球狀 C 末端結(jié)構(gòu)域組成 [1]。體內(nèi)脂聯(lián)素以不同的低聚物出現(xiàn)。除三聚體和三聚體外，還存在高分子多聚體 [1～3]。到目前為止，已知有兩種不同的受體，兩種受體普遍表達(dá)，盡管在組織中的分布各不相同。脂聯(lián)素受體 1 (AdipoR1) 尤其在肝組織的肌肉和 AdipoR2 中合成 [4]。

對人類有機體的意義直到現(xiàn)在還不*清楚。初的研究表明，脂聯(lián)素與 BMI 呈負(fù)相關(guān)，因此它可能與能量代謝相關(guān)，例如通過調(diào)節(jié)脂肪酸氧化。除了與 BMI 相關(guān)外，脂聯(lián)素水平還與胰島素抵抗相關(guān) [5-7]，因此也與 II 型糖尿病相關(guān)。脂聯(lián)素也與葡萄糖和脂肪代謝相關(guān) [8,9]。

如重復(fù)描述，在三種檢測系統(tǒng)的比較研究中無法證明高分子多聚體的特殊診斷意義 [10]。

此外，脂聯(lián)素參與炎癥過程 [11-15]，并對  動脈硬化 [4，5，16] 和冠狀動脈炎 [17，18] 的出現(xiàn)。因此，測定血漿中的脂聯(lián)素水平可用于估計冠狀動脈疾病的風(fēng)險 [19,20]。除此之外，脂聯(lián)素還影響進(jìn)一步的生理過程，例如血管生成 [21,22]。

4

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5 TECOmedical

試驗原理

Adiponectinisaso 的 teco® 檢測試劑盒稱為 Sandwich-Assayusingtwospecificandhighaffinitymonoclonal antibodies。樣本中的脂聯(lián)素與包被在微量滴定板上的抗體結(jié)合。在下一步中，第二種特異性抗脂聯(lián)素抗體依次與固定的脂聯(lián)素結(jié)合。第二種抗體生物素化，并與鏈霉親和素-過氧化物酶-酶結(jié)合物在混合物中孵育。在關(guān)閉底物反應(yīng)中，根據(jù)樣品的脂聯(lián)素水平，將定量催化顏色的變化。

需要但未提供的材料

• 能夠分配 5 μL、40 μL、80 μL、100 μL、320 μL、350 μL、500 μL、560 μL 和 750 μL 的移液器

• 用于復(fù)溶或稀釋試劑的量筒

• 手動抽吸系統(tǒng)和多通道移液器或自動清洗器

• 蒸餾水

• 渦旋混合器

• ELISA 酶標(biāo)儀適用于 96 孔板，能夠在 450 和 405 nm 處測定（參比波長：590–650 nm）。

• ELISA 板振蕩器 (350 rpm)（定軌振蕩器）

• 用于數(shù)據(jù)生成和分析的軟件包

警告和注意事項

本試劑盒僅供專業(yè)人員在體外使用。

認(rèn)真遵循說明。

觀察標(biāo)簽上注明的失效日期和復(fù)溶試劑的規(guī)定穩(wěn)定性。更詳細(xì)的安全信息請參見“材料安全數(shù)據(jù)表”。本試劑盒制備中使用的人源材料已經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn)對 HIV-1 和 HIV-2 以及 HCV 抗體和 HbsAg 無反應(yīng)性，但應(yīng)視為具有潛在傳染性進(jìn)行處理。TECOmedical AG 對于因未遵守試劑盒說明造成的損失或傷害不承擔(dān)任何責(zé)任。

1. 用于體外診斷。

2. 將所有樣本視為具有潛在生物危害性的材料。處理本試劑盒內(nèi)容物和任何患者樣本時，請遵循一般注意事項。

3. 應(yīng)按照聯(lián)邦和當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)要求處置容器和未使用的內(nèi)容物。

4. 在包裝標(biāo)簽上注明的失效日期之前，使用提供的試劑作為一個整體。請勿使用明顯損壞或被微生物污染或溢出的材料。

5. 按照指示儲存測定試劑。

6. 如果包裝袋被刺破，請勿使用涂層條。

7. 每份樣品重復(fù)檢測兩次。

8. 建議使用多通道移液器或重復(fù)移液器，以確保液體的及時輸送。

9. a) 0,2m 硫酸具有腐蝕性，可引起嚴(yán)重?zé)齻?/p>

b) 小心處理 TMB。

Do  不  攝入。  避免  接觸  與  皮膚，  眼睛，  or  衣物。  If  接觸  is  制成，  清洗  與  水。        如果攝入，請就醫(yī)。

10. 使用 5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和 2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮的混合物作為防腐劑 (< 0.015%)。

請勿攝入。避免接觸皮膚、眼睛或衣物。如果發(fā)生接觸，用水清洗。如果攝入，請就醫(yī)。

6

試劑制備

1 包被抗人脂聯(lián)素抗體的微量滴定板

將 12 個分離條（共 8 個孔，共 96 個）分隔成一幀，并密封在鋁箔袋中。將條帶孔牢固地裝入框架中。打開后，立即返回  任何  未使用  孔  to  的  原始  箔  包裝  和  密封。  在 2–8 ℃ 下儲存至失效日期。初次開啟后，組件的有效期為 4 周。

A 標(biāo)準(zhǔn)至5 瓶含天然脂聯(lián)素（2、10、30、70 和 100 ng/mL）的凍干標(biāo)準(zhǔn)品。復(fù)溶

各 E  標(biāo)準(zhǔn)  與  750  μl  of  稀釋度  緩沖液。  保存  復(fù)溶  試劑  at  房間  溫度  15 min，然后用渦旋器輕輕混合（無泡沫！）。復(fù)溶后，標(biāo)準(zhǔn)品可在-20 ℃ 下穩(wěn)定儲存 1 個月。僅一個凍融循環(huán)或等分保存。凍干品在 2-8 ℃ 下儲存。

L 質(zhì)控品 1

1 瓶凍干對照品（人血清）。用 500 μL 稀釋緩沖液復(fù)溶。將復(fù)溶試劑在室溫下放置 15 min，然后用渦旋器輕輕混合（無泡沫！）。復(fù)溶后，質(zhì)控血清在-20 °C 條件下可穩(wěn)定儲存 1 個月。僅 1 個凍融循環(huán)或等分保存。有關(guān)精確值，請參閱數(shù)據(jù)表。凍干品在 2-8 ℃ 下儲存。

H 對照 2

1 瓶凍干對照品（人血清）。用 500 μL 稀釋緩沖液復(fù)溶。將復(fù)溶試劑在室溫下放置 15 min，然后用渦旋器輕輕混合（無泡沫！）。復(fù)溶后，質(zhì)控血清在-20 °C 條件下可穩(wěn)定儲存 1 個月。僅 1 個凍融循環(huán)或等分保存。有關(guān)精確值，請參閱數(shù)據(jù)表。凍干品在 2-8 ℃ 下儲存。

2 稀釋緩沖液

125 mL 1 支，即用型。緩沖液中可能存在沉淀，使用前通過混合和/或加熱解決。在 2–8 ℃ 下儲存至失效日期。初次開封后，組件的失效日期  保證 4 周。

3 抗體-HRP 結(jié)合物

1 瓶 12 mL，即用型。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人脂聯(lián)素。在 2–8 ℃ 下儲存至失效日期。初次開啟后，組件的失效日期為       4 周。

4 TMB 底物

1 瓶 12 mL。備用。在 2–8 ℃ 下儲存至失效日期。初次開啟后，組件的有效期為 4 周。

5 清洗緩沖液

1 瓶 50 mL 緩沖液。緩沖液中可能存在沉淀，使用前通過混合和/或加溫使小瓶內(nèi)容物用蒸餾水補足至 1000 mL 解決。稀釋后的洗滌液在 2–8 °C 下可穩(wěn)定儲存 4 周。未稀釋的洗滌液在 2–8 °C 下儲存直至失效日期。初次開啟后，組件的有效期為 4 周。

6 終止液 –0.2 MH2SO4

• 12 mL 0.2 MH2SO4 小瓶。備用。在 2–8 ℃ 下儲存至失效日期。初次開啟后，組件的有效期為 4 周。

7 微量滴定板蓋

• 碎片、粘合劑。

7 TECOmedical

血清樣本的制備和穩(wěn)定性

樣本類型

建議空腹采集血樣。人血清或血漿、乳汁、尿液、CSF 和  細(xì)胞  培養(yǎng)。在血清和肝素血漿中發(fā)現(xiàn)了相似的值，但在 EDTA 和檸檬酸鹽血漿中，樣本值為  降低 18%。

脂聯(lián)素：

血清與 EDTA 血漿 –5 種不同檢測中的 20 份樣本

穩(wěn)定性

• 室溫下多 2 天
• Maximum 2 years at -20 °C 下長 2 年
• 多 3 個凍融循環(huán)

注

樣品必須用稀釋緩沖液稀釋。樣品稀釋后的樣品穩(wěn)定性：多 1 小時    20-25 ℃ 下

大多數(shù)情況下（對于血清或血漿樣本，如果預(yù)期無極值），用稀釋緩沖液以 1:200 至 1:1600 的稀釋度應(yīng)該是合適的。根據(jù)預(yù)期的脂聯(lián)素水平，稀釋度可能較高或較低。除血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清液外，人源體液中的脂聯(lián)素濃度可能*不同。

一般而言，血清或血漿樣本的 1:300 稀釋因子適用于臨床診斷。樣品稀釋后的樣品穩(wěn)定性：20-25 ℃ 下多 1 小時。

稀釋方案建議：

• 一步稀釋 (1:300)：

將 5 μL 樣品稀釋于 1.5 mL 稀釋緩沖液中

• 兩步稀釋 1:300：

1. 向 560 μL 稀釋緩沖液中加入 40 μL 血清或血漿，按 1:15 稀釋（建議在較大系列中應(yīng)用多步進(jìn)器）。

2. 然后將 20 μL 充分混合的一份稀釋液加入 380 μL 稀釋緩沖液中。混合后，使用 2 × 100 μL

來自試驗中的該稀釋樣品。

8

測定程序

所有測定（標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋的血清質(zhì)控品和稀釋的樣本）應(yīng)重復(fù)測定兩次。進(jìn)行測定時，應(yīng)盡快 (< 15 min) 移取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清和樣本。為避免由于孵育時間的差異導(dǎo)致的失真，應(yīng)以與樣品相同的順序和相同的時間間隔向微孔板中加入 HRP 結(jié)合物、底物溶液和終止液。允許使用所有試劑   在室溫 (20-25 ℃) 下靜置至少 30 min。復(fù)溶后，將試劑在室溫下放置 15 min，使用前輕輕混勻。

1. 準(zhǔn)備框架和所需數(shù)量的涂層條 1。

2. 為標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和樣品分配微量滴定板的孔。

稀釋樣品，見第 8 頁和對照品 (1:300)。

3. 移取 100 μL 稀釋緩沖液 2，一式兩份，置于微孔中（空白）。

4. 移取 100 μL 各標(biāo)準(zhǔn)品 (A-E)、稀釋的對照血清（l 和 H）和樣品（見稀釋方案）至相應(yīng)孔中。

5. 用密封膠帶覆蓋微孔，并在微孔板振蕩器 (350 rpm) 上于室溫 (20–25 ℃) 下孵育微孔板 1 小時

• 孵育后，使用洗板機吸取微孔，或通過倒置微孔板手動傾倒微孔。  用 350 μL 稀釋的清洗緩沖液清洗微孔 3 次（每個循環(huán)孵育 15 秒）。后一次清洗循環(huán)后，在干燥的吸收劑表面上輕輕敲擊倒置的微孔，以除去多余的清洗液。

7. 在每個孔中移取 100 μL 抗體 HRP 結(jié)合物 3。

8. 用密封膠帶覆蓋微孔，并在微孔板振蕩器 (350 rpm) 上于室溫 (20–25 ℃) 下孵育微孔板 30 min。

9. 按照步驟 6 所述，用清洗緩沖液清洗微孔 3 次。

10. 在每個孔中移取 100 μL TMB 底物溶液 4。

11. 在室溫 (20-25 ℃) 下避光孵育平板 15 min。

12. 每孔加入 100µl 終止液 6。

13. 在 30 min 內(nèi)測量 450 nm 處的顯色反應(yīng)（參考濾光片在 590–650 nm 之間）。具有強顯色反應(yīng)，例如 > 3 OD，也可在 405 nm 處測量。

不同自動 ELISA 系統(tǒng)的方案可用。

結(jié)果分析

為評價含量測定，空白的吸光度值應(yīng)低于 0.25，標(biāo)準(zhǔn)品 E 的吸光度值應(yīng)超過 1.0，對于吸光度值高于標(biāo)準(zhǔn)品 E 的樣品，應(yīng)使用更高的稀釋度再次進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 x 軸（線性標(biāo)度），以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度為 y 軸（線性標(biāo)度），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取稀釋患者血清中的脂聯(lián)素濃度。應(yīng)使用 4 參數(shù)曲線擬合進(jìn)行自動數(shù)據(jù)簡化。通過將標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的值乘以稀釋因子獲得樣本和對照品的脂聯(lián)素濃度。

質(zhì)量控制

良好實驗室  練習(xí)  要求  那  控制  是  包括  in  每個  含量測定。  A  統(tǒng)計學(xué)  顯著  編號  的質(zhì)控品應(yīng)進(jìn)行測定，以建立  平均值  數(shù)值  和  可接受  范圍  to  保證  適當(dāng)?shù)谋憩F(xiàn)。只有按照說明進(jìn)行試驗，試驗結(jié)果才有效。此外，用戶必須嚴(yán)格遵守 GLP（藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范）規(guī)則或其他適用聯(lián)邦、州或當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)/法律。所有標(biāo)準(zhǔn)品和試劑盒質(zhì)控品必須在 QC 證書規(guī)定的可接受范圍內(nèi)。          如果不符合標(biāo)準(zhǔn)，則運行無效，應(yīng)重復(fù)運行。各實驗室應(yīng)使用已知樣本   作為進(jìn)一步控制。

9 TECOmedical

450 nm 處的典型結(jié)果

（僅為示例。不用于計算實際結(jié)果）

*通過稀釋因子 1:300 校正

對于每次測定，質(zhì)控品的結(jié)果必須在每個批次指示的目標(biāo)范圍內(nèi)。試劑盒提供了包含目標(biāo)范圍的 QC 方案。如果質(zhì)控值不在目標(biāo)范圍限值內(nèi)，則應(yīng)將測定結(jié)果視為可疑，并應(yīng)再次檢測樣本。

結(jié)果解釋

檢測結(jié)果不應(yīng)成為治療決策的依據(jù)。應(yīng)根據(jù)既往病歷、進(jìn)一步臨床觀察結(jié)果和其他診斷研究的結(jié)果解釋結(jié)果。此外，建議為每個實驗室建立與相關(guān)患者組相對應(yīng)的參考值和臨界值。

程序限制

TECO 敏感的人脂聯(lián)素 ELISA (TE1013) 基于單克隆抗體。通常，該技術(shù)對樣本中的異嗜性抗體或風(fēng)濕因子敏感。通過試驗設(shè)計降低了其影響，但不能*排除。

10

參考值

使用 TECO®ELISA 試劑盒在健康供體中測定的血清脂聯(lián)素預(yù)期值如下所示。這些數(shù)據(jù)顯示脂聯(lián)素-血清值與健康受試者的年齡和性別顯著相關(guān)。反過來，各自 BMI 之間的相關(guān)性似乎不太顯著。在新生兒臍帶血樣本中發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素值*。

成人預(yù)期值，性別特異性

預(yù)期值，特定年齡

11 TECOmedical

 與 BMI 相關(guān)的特定年齡和性別的預(yù)期值

BMI = 體重指數(shù) (kg/m2)

12

測試性能

校準(zhǔn)

試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品由天然脂聯(lián)素（人血清）制備，并根據(jù)重組蛋白進(jìn)行定量。

精密度（批間）

（測定內(nèi)）

檢測限

+ 2 標(biāo)準(zhǔn)偏差時的檢測下限 (LLOD) 為 < 0.27 ng/mL。

回收試驗

血清基質(zhì)中重組脂聯(lián)素的回收率平均為 110%。

13 TECOmedical

稀釋試驗

干擾

向血清樣本中加標(biāo)不同濃度的可能干擾物質(zhì)，測量脂聯(lián)素的量，并與未加標(biāo)的相同樣本中的脂聯(lián)素濃度進(jìn)行比較。所有供試品均未對脂聯(lián)素測定產(chǎn)生顯著干擾。

交叉反應(yīng)性

與以下種屬無交叉反應(yīng)：馬、牛、雞、兔、犬、豚鼠、綿羊、小鼠、山羊、驢、大鼠、貓、豬。

備注

本說明書引用的數(shù)據(jù)僅供參考。建議每個實驗室在測定中包括自己的一組對照樣本。為了遵循 GLP 指南，各實驗室應(yīng)建立自己的脂聯(lián)素水平正常和病理范圍。

TECO® 總?cè)酥?lián)素

 測定程序-快速指南

使用快速指南前，請閱讀試劑盒說明

標(biāo)準(zhǔn)曲線 艾克庫爾 Courbe 標(biāo)準(zhǔn)

日期 04.06.2020