SphereOTM技術(shù)說明STN-21

SPHEROTM Technical Note STN-21 Rev A 050520

SPHEROTM STREPTAVIDIN PARTICLES USES AND PROTOCOLS

SPHEROTM鏈霉親和素顆粒的用途和協(xié)議

鏈霉親和素
鏈霉親和素是一種蛋白質(zhì)（分子量約66000），由四個相同的亞單位組成，每個亞單位都含有生物素的高親和力結(jié)合位點(diǎn)（KD=10-15）
M） 。它與抗生物素蛋白具有相同的生物素結(jié)合特性，但觀察到的非特異性結(jié)合較少。它已被用于免疫分析和基因組分析
用于目標(biāo)檢測的分析。
道德原則
Spherotech鏈霉親和素珠表面設(shè)計為簡單有效方法的基質(zhì)，例如：
•用于分離生物素化化合物（如蛋白質(zhì)、免疫球蛋白、糖、凝集素或DNA/RNA和microRNA）的蛋白質(zhì)包覆珠
•磁性鏈霉親和素包衣珠可用作免疫分析和基因組分析的基質(zhì)
•熒光標(biāo)記的鏈霉親和素小顆粒可用作檢測探針。

使用說明
Spherotech鏈霉親和素顆粒的制備
使用前應(yīng)清洗顆粒，以去除0.02%的NaN3
作為防腐劑添加的。通過使用
較大顆粒的離心。
1.輕輕搖動小瓶，以獲得均勻的懸浮液。
2.向管中添加適量的顆粒（見下文“結(jié)合能力"一節(jié)）。
3.將試管置于1.5K的離心機(jī)中20分鐘。
4.用移液管抽吸上清液。避免用移液管端接觸顆粒顆粒。
5.添加推薦的緩沖區(qū)。使用與上述步驟2中相同的體積，然后輕輕地重新使用（不要使珠子產(chǎn)生漩渦）。
6.重復(fù)步驟3至5，最后一次清洗后，添加適當(dāng)體積的推薦緩沖液，以獲得適當(dāng)?shù)墓ぷ鳒囟?br/>顆粒濃度。

用于RNA操作的Spherotech鏈霉親和素顆粒的制備。
注：Spherotech鏈霉親和素不以無核糖核酸酶溶液提供。
1.向溶液a和溶液B中添加DEPC至0.1%（1ml/L）的最終濃度（見下文緩沖液和溶液部分）。
2.用力搖晃。
3.在室溫下培養(yǎng)1小時，并對溶液進(jìn)行高壓滅菌。
4.用相同體積的溶液A沖洗顆粒兩次，持續(xù)1-3分鐘。
5.用相同體積的溶液B清洗顆粒一次。
6.將顆粒重新懸浮在溶液B中。
生物素化程序
生物素化核酸、蛋白質(zhì)和肽很容易與Spherotech鏈霉親和素磁性顆粒結(jié)合，用于分離實(shí)驗(yàn)。遵循
在結(jié)合過程中，由于Spherotech磁粉的*磁性，生物素化產(chǎn)物易于操作。這個
當(dāng)粒子置于磁場中時，其磁性能簡化實(shí)驗(yàn)過程中的操作，如更換緩沖液。
生物素/鏈霉親和素連接系統(tǒng)（KD=10-15 M）的結(jié)合導(dǎo)致隔離的*非共價相互作用。
筆記：
•所有生物素試劑應(yīng)包含一個間隔臂，長度至少為6個C原子，以減少空間位阻。
•樣品中的游離生物素會降低Spherotech鏈霉親和素顆粒的結(jié)合能力。一種可一次性使用的裝有液體的柱
Sephadex®將從樣品中去除未結(jié)合的生物素。
•生物素化寡核苷酸應(yīng)通過反相高效液相色譜法純化，以獲得最佳結(jié)合效率。
•建議在寡核苷酸引物的5′端進(jìn)行特異性生物素化，以保持3′端游離延伸。

寡核苷酸引物的生物素化。
a） 生物素化寡核苷酸可從寡核苷酸合成公司購買。
b） 合成反應(yīng)中的生物素磷酰胺允許生物素在5'-端發(fā)生，對標(biāo)記的寡核苷酸的特異性或熔化溫度沒有影響。
c） 通過化學(xué)摻入5'-或3'-氨基修飾的寡核苷酸進(jìn)行生物素化，將導(dǎo)致生物素酯的所有伯胺基團(tuán)
寡核苷酸。建議在DNA合成過程中直接將低聚物的5'端或3'端加入生物素。
2.生物素化引物的純化。
a） 生物素化寡核苷酸最好通過反相HPLC從未結(jié)合的生物素中純化，這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)橛坞x生物素
將占據(jù)珠子上的結(jié)合位點(diǎn)，并降低生物素化PCR產(chǎn)物的結(jié)合能力。這一凈化步驟也確保了全長
標(biāo)記水平接近100%的脫氧核苷酸。
b） 生物素化寡核苷酸的HPLC純化是將全長生物素化寡核苷酸裝載到鏈霉親和素包衣珠上所必需的。
NAP柱純化的寡核苷酸影響裝載過程。
3.已合成寡核苷酸的生物素化。
Photobiotin®標(biāo)記系統(tǒng)可將生物素引入已合成的低聚物中。生物素隨機(jī)并入寡核苷酸中。
4.較大DNA的片段的生物素化。
a） 建議在使用生物素磷酰胺進(jìn)行DNA合成期間，在低聚物的5'端直接加入生物素。a）使用帶有生物素化引物的PCR進(jìn)行末端標(biāo)記。
b） 酶法結(jié)合生物素dUTP標(biāo)簽。生物素dUTP標(biāo)簽可通過使用Klenow DNA聚合酶、缺口翻譯或混合引物標(biāo)記的末端標(biāo)記，以酶法并入雙鏈DNA的片段。
c） 光生物素化。生物素的光活化形式可以在紫外光下隨機(jī)并入DNA的片段。
5.使用可切割試劑進(jìn)行生物素化。
a） 生物素dUTP類似物與可切割連接物的酶結(jié)合。生物素與含有二硫化物的連接臂的結(jié)合
該鍵允許DNA的片段的簡單解離，因?yàn)槎蜴I很容易被二硫蘇糖醇（DTT）切割。這種試劑
通過末端標(biāo)記、缺口翻譯或混合引物標(biāo)記將酶結(jié)合到DNA的片段中。建議使用生物素-21 SS dUTP。
b） NHS生物素鳥苷類似物的化學(xué)摻入。亞氨基生物素的摻入允許結(jié)合核酸的解離
pH值發(fā)生簡單變化的酸片段。鏈霉親和素/亞胺生物素復(fù)合物在pH 4.0下解離。在pH值為9.5或更高時，亞胺生物素將與Spherotech鏈霉親和素顆粒緊密結(jié)合。釋放的亞胺生物素可重新固定在Spherotech鏈霉親和素顆粒上。